Головна » Гіди по здоров'ю » ВІЛ / СНІД » Імунний блот в діагностиці ВІЛ

Імунний блот в діагностиці ВІЛ

Імунний блот (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - Поєднує в собі імуноферментний аналіз (ІФА) з попереднім електрофоретичної перенесенням на нітроцелюлозну смужку (стрип) антигенів вірусу.

У цьому красивому вченій назві «blot» перекладається швидше за все як «клякса», а «western» - як «західна» відображає напрямок поширення цієї «плями» по паперу зліва направо, тобто на географічній карті це відповідає напрямку із заходу на схід. ». Суть методу «імунний блот» полягає в тому, що імуноферментну реакцію проводять не з сумішшю антигенів, а з антигенами ВІЛ, попередньо розподіленими методом іммунофореза по фракціям, що розташовуються згідно молекулярній вазі по поверхні нітроцелюлози мембрани. В результаті основні білки ВІЛ, носії антигенних детермінант, розподіляються по поверхні у вигляді окремих смуг, які і проявляються при проведенні імуноферментної реакції.

Імуноблот включає в себе кілька стадій:

Підготовка стрипу. Попередньо очищений і зруйнований до складових компонентів вірус імунодефіциту (ВІЛ) піддається електрофорезу, при цьому входять до складу ВІЛ антигени розділяються по молекулярній вазі. Потім методом блоттинга (аналог видавлювання на "промокашку" надлишку чорнила) антигени переносять на смужку нітроцелюлози, яка відтепер містить невидимий поки оком спектр антигенних смуг, характерний для ВІЛ.

Дослідження проби. На нітроцелюлозну смужку наноситься досліджуваний матеріал (сироватка, плазма крові пацієнта і т.п.), і якщо в пробі є специфічні антитіла, то вони зв'язуються зі строго відповідними їм (компліментарними) антигенними смугами. В результаті подальших маніпуляцій результат цієї взаємодії візуалізується - робиться видимим.

Трактування результату. Наявність смуг в на певних ділянках нітроцелюлози пластини підтверджує присутність в дослідженої сироватці антитіл до строго певним антигенів ВІЛ.

  • Смужка А - Позитивний контроль
  • Смужка В - Слабопозитивний контроль
  • Смужка С - Негативний контроль
  • Смужка D - Позитивний зразок (виявлено присутність антитіл до ВІЛ-1)
  • В даний час імунний блот (імуноблот) є основним методом для підтвердження наявності вірусспеціфіческіх антитіл в досліджуваній сироватці. В деяких випадках ВІЛ-інфекції, до розвитку сероконверсії, специфічні антитіла більш ефективно виявляються методом імунного блоттинга, ніж ІФА. При дослідженні методом імунного блоттинга виявлено, що найчастіше в сироватках хворих на СНІД виявляються антитіла до gp 41, причому виявлення р24 в осіб, обстежуваних з профілактичною метою, вимагає додаткових досліджень на наявність у них ВІЛ-інфекції. Тест-системи для імунного блоттинга на основі рекомбінантних білків, отриманих шляхом генної інженерії, виявилися більш специфічними, ніж звичайні системи на основі очищеного вірусного лізата. При використанні рекомбінантного антигену формується не дифузна, а чітко виражена вузька смужка антигену, легко доступна для обліку та оцінки.

    Сироватки осіб, інфікованих ВІЛ-1, виявляють антитіла до наступних основних білків і гликопротеидам - ??структурним білкам оболонки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а також ферментів вірусу (pol) - p31 , p51, p66. Для ВІЛ-2 типові антитіла до env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

    Серед лабораторних методів, необхідних для встановлення специфічності реакції, найбільше визнання має виявлення антитіл до білків оболонки ВІЛ-1-gp41, gp120, gp160, і ВІЛ-2 - gp36, gp105, gp140.

    ВООЗ вважає позитивними сироватки, в яких методом імунного блотингу виявляються антитіла до будь-яких двох гликопротеидам ВІЛ. Згідно з цими рекомендаціями, при наявності реакції тільки з одним з білків оболонки (гп 160, гп 120, гп 41) в поєднанні або без реакції з іншими білками, результат вважається сумнівним і рекомендується повторне дослідження, використовуючи набір іншої серії або іншої фірми. Якщо і після цього результат залишається сумнівним, рекомендується спостереження протягом 6 місяців (дослідження через 3 місяці).

    Наявність позитивної реакції з антигеном p24 може вказувати на період сероконверсії, так як антитіла саме до цього білка іноді з'являються першими. В цьому випадку рекомендується, в залежності від клінічних та епідеміологічних даних, повторити дослідження зі зразком сироватки, взятим як мінімум через 2 тижні, і це є саме тим випадком, коли при ВІЛ-інфекції необхідно дослідження парних сироваток.

    Позитивні реакції з білками gag і pol без наявності реакції з білками env можуть відображати стадію ранньої сероконверсії, а також може вказувати на ВІЛ-2 інфекцію або на неспецифічну реакцію. Осіб з такими результатами після тестування на ВІЛ-2 повторно досліджують через 3 місяці (протягом 6 місяців).

    Якщо через 6 місяців знову будуть отримані невизначені результати (відсутність реакції з білками env ВІЛ-1 і ВІЛ-2), а також не будуть виявлені фактори ризику і клінічні симптоми імунодефіциту, то зазвичай роблять висновок про неспецифічної реакції імунної блотингу. Вважається, що в разі істинної ВІЛ-інфекції зазвичай після декількох місяців спостереження за спектром антитіл визначається "позитивна" динаміка - тобто поява антитіл до інших структурам ВІЛ, а на нітроцелюлози в імунний блот спостерігається поява відсутніх для діагностики смуг. Навпаки, в разі помилкової реакції результати імунного блотингу залишаються невизначеними або стають "негативними", тобто "підозрілі" смуги зникають.

    Всесвітня Організація Охорони Здоров'я (ВООЗ, 1991) рекомендує наступну оцінку результатів досліджень, проведених методом імунного блоттинга:

  • Позитивний результат - виявлення в сироватці антитіл до двох вірусним білкам з групи env з наявністю або відсутністю білків - продуктів інших структурних генів (gag, pol);
  • Негативний результат - відсутність антитіла до вірус-специфічних білків;
  • Невизначений результат - виявлення в сироватці антитіл до білків з груп gag, pol.
  • При отриманні сумнівного результату з антитілами до білків серцевини (gag) в імунній блотингу з антигенами ВІЛ-1 проводиться дослідження з антигенами ВІЛ-2.

    При отриманні позитивних результатів імунного блотингу робиться висновок про наявність в досліджуваному матеріалі антитіл до ВІЛ.

    При отриманні негативного результату аналізу в ІБ видається висновок про відсутність антитіл до ВІЛ.

    При отриманні невизначеного результату проводяться повторні дослідження на антитіла до ВІЛ через 3 місяці і при збереженні невизначених результатів - через 6 місяців.

    Як правило, невизначена реакція в імунному блоттинга пов'язана з наявністю білків - продуктів експресії гена gag ВІЛ-1 р15/17, р24 і Р55, що може свідчити як про хибнопозитивної реакції, так і про можливість інфікування ВІЛ-1.

    Якщо через 6 місяців знову будуть отримані невизначені результати, а у пацієнта не будуть виявлені фактори ризику зараження і клінічні симптоми ВІЛ-інфекції, результат розцінюється як хибно позитивний. (При наявності епідеміологічних і клінічних показань серологічні дослідження повторюються за призначенням).

    Так як імунний блотингу, всупереч поширеній думці, є менш чутливою методикою, ніж твердофазний імуноферментний метод, то в деяких країнах допускають постановку серологічного діагнозу після виявлення антитіл до ВІЛ за допомогою декількох тест-систем для імуноферментного твердофазного аналізу, що відрізняються за складом антигенів. Ефективність методу імунного блотингу знижує виявлення досить великого числа "не інтерпретуються" або "невизначених" результатів.




    © При використанні даного матеріалу посилання на MedicLab обов'язкове