Головна » Гіди по здоров'ю » Грип » Протокол детального піросеквенірованія М2 вірусу грипу А (H1N1) для тестування сприйнятливості вірусу грипу А (H1N1) до антивірусних препаратів

Протокол детального піросеквенірованія М2 вірусу грипу А (H1N1) для тестування сприйнятливості вірусу грипу А (H1N1) до антивірусних препаратів

ВСЕСВІТНЯ ОРГАНІЗАЦІЯ ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я

13 травня 2009 H1N1

Співпрацює центр грипу ВООЗ на базі Центру контролю і профілактики захворювань (CDC),Атланта, США, надає протокол детального піросеквенірованія М2 вірусу грипу А (H1N1) для тестування сприйнятливості вірусу грипу А (H1N1) до антивірусних препаратів.

Даний документ містить оновлення, що стосується протоколу піросеквенірованія длятестування антивірусного сприйнятливості, опублікованого 29 квітня 2009.

CDC Фахівці молекулярної епідеміології Відділення контролю і діагностики вірусних захворювань
Центри контролю іпрофілактики захворювань, Національний центр з імунопрофілактики та нагляду за респіраторними інфекціями (NCIRD) та Координаційний центр з інфекційних захворювань (CCID), Відділення грипу Назва SOP (Standard operating procedure - стандартне проведення процедури): Протоколдетального піросеквінірованія М2 свинячого вірусу грипу H1N1

Дата вступу в силу: 11 травня 2009.

Піросеквенірованіе гена М2 для виявлення резистентності до препаратів похідних адамантану (амантадин іремантадин)

ОТ-ПЦР праймери (20 мкм):

  • sw-M2-F670 AGC TCC AGT GCT GGT CTG AAA G
  • sw-M2-R900-biot, GAC TCA GGC ACT CCT TCC GTA GAA
  • Праймер послідовності (100 мкм):

  • sw-M2-F747-seq, GCG ATT CAA GTG ATC C
  • Протокол ОТ-ПЦР: Використання системи Invitrogen Superscript III однокрокової ОТ-ПЦР з HiFi Taq-полімеразою.

    Обсяг мкл
    2Х реакційна суміш 25.
    Superscript III HiFi Taq- 1.
    Прямий праймер (20мкм) 1.
    Зворотній праймер (20 мкм) 1.
    Інгібітор РНКази 0.5
    Вода, яка не міститьнуклеаз 16.5
    Підсумковий об'емобразци 45.
    Зразок 5.
    Підсумковий обсяг 50.

    Параметри циклічності ПЛР:

    Температура Тривалість
    50. 30 хвилин
    94. 2 хвилини
    94. 15 секунд 45 циклів
    55. 30 секунд
    68. 60 секунд
    68. 5 хвилин
    4. затримка

    Протокол піросеквінірованія: Використання PyroGold реагентів (для 96 зразків)

    Реакція зв'язування

  • Зв'язуючий буфер: 4 мл.
  • Дистильована вода (Н2О): 2 мл.
  • Гранули сефарози (добре перемішані): 300 мкл.
  • Суміш, добре перемішана вмішалці.
  • Внести 60 мкл зв'язує буфера в кожну лунку чистого 96-лункового планшета для ОТ-ПЦР (використовувати планшет з 12 рядами).
  • Додати 20 мкл реагентів ОТ-ПЦР у відповідні лунки, що містять зв'язуючий буфер.
  • Накрити плашку фотострічках.
  • Потрясти плашку, по крайней мере, 10 хвилин.
  • Реакція відпалу:

  • Буфер для відпалу: 4.4 мл.
  • Праймер послідовності: 20мкл (sw-M2-F747 seq) на 100 мкм.
  • Перемішати в мішалці і додати 40 мкл реакції відпалу в кожнулунку 96-лункового м'якого планшета для піросеквірованія.
  • Порядок поділу : циклічний 60 (CATGGT).

    Використовуваний модуль : SQA (аналіз послідовності).

    Аналізованапослідовність :

    Метою піросеквінірованія М2 є порівняння ділянок сезонних вірусів грипу H1N1 та H3N2 з вихідним зразком свинячого вірусу грипу 2009 H1N1: (при порівнянні з сезонним вірусом H1N1 спостерігається відміну в один нуклеотиді одну амінокислоту, як це показано і виділено червоним кольором нижче).

    25.

    26.

    27.

    28.

    29.

    30.

    31.

    32.

    33.

    34.

    35

    36.

    37.

    38.

    Н3:

    P

    AC CCG

    L

    CTT

    V

    GTT

    V

    GTT

    A.

    GCC

    A.

    GCG

    N

    AAT

    I

    ATC.

    I

    ATT.

    G

    GGG

    I

    ATC.

    L

    TTG

    H

    CAC

    L

    TTG AT

    Н1:

    P

    AC CCT

    L

    CTT

    V

    GTT

    V

    GTT

    A.

    GCC

    A.

    GCA

    S

    AGT.

    I

    ATA

    I

    ATT.

    G

    GGG

    I

    ATT.

    V

    GTG

    H

    CAC

    L

    CTG AT

    swН1:

    P

    AC CCT

    L

    CTC

    V

    GTC

    I

    ATT.

    A.

    GCA

    A.

    GCA

    N

    AAT

    I

    ATC.

    I

    ATT.

    G

    GGG

    I

    ATC.

    L

    TTG

    H

    CAC

    L

    CTG AT

    Встановлені маркери резистентності до блокаторів М2 (амантадин і ремантадин):

  • L26F (CTTC до TTT)
  • V27A (GTT до GCT)
  • A30VT (GCG до GTG), або GCN до GTN, GCG до ACG
  • S31N (AGTC до ATTC)
  • G34E (GGG до GAG)
  • Оригінальний зразок вірусу свинячого грипу 2009 H1N1 резистентний до препаратів похідним адамантану і має зміни S31N і відповідно змінений М2 білок (AGT --- AAT).




    © При використанні даного матеріалу посилання на MedicLab обов'язкове